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关于高液相等度洗脱，流动相比例越简越好，能不用缓冲盐不用，洗脱方越简越好、色谱柱越常见越好，但是有的时候用比例的流动相或者是常见色谱柱是无满足很多杂质的分离，这时需重新开发色谱分离方式。
1、确定目标化合物质
先需要明待分离杂质的些质，比如说分子量、结构式（主要看有哪种基团），以及该种物质在哪种有机溶中易容。结构式对于分子大小的预测以及判定该物质是否容易水解有非常重要的作用。例如我们常见的-、-NHR、-、-COOH、-0H等都是比较常见的基团；而常见的-环、-CH=、--等都是常见的非基团。根据经验可以大致的判断下物质的，预估下在常用的色谱柱上是否保留，再结合杂质在各种常见洗脱溶中的溶解，例如在甲-、乙腈、正己烷中哪个比较易溶，选择适合用于洗脱的有机流动相，从而确定方开发时是用正相色谱柱或者是反向色谱柱做出粗略判断。
2、确定正反相洗脱方式
确定洗脱方式后，反向的话个人推荐先用60的乙腈或者是甲-，先去看下你需要分离的几种物质能否被分开，（正相洗脱方式思路相近）。在能分开的前提下，再看下后个峰的出峰时间，如果时间比较长的话，再根据前几个峰的分离度确定是否需要加大或者缩小有机相的比例。我们常见的洗脱分离方式为反相分离，而反相洗脱方式又分为两种系，种是甲--水系，另外种是乙腈-水系。
具是选择哪种反相洗脱系需要根据以下条件来决定：
A、乙腈的洗脱能力要于甲-，在同等浓度、样品下乙腈-水系的目标峰出峰要快于甲--水系。
B、甲-溶于水是会放出热量的，乙腈溶于水是会吸热的，在同等方式的梯度洗脱方式下，在两种流动相互相混合时由于分子热运动的原因，甲-溶于水比乙腈溶于水时的分子热运动剧烈，这样两种流动相的混合会加均匀，反映在基线上的表现为基线加的平滑，且梯度峰要少。
C、甲-在--面上的售价要低于乙腈（如果财大气粗的公司可以忽略这条）。
D、甲-的分子量大于乙腈，在同色谱柱、相同浓度的有机相浓度下，乙腈-水系的柱压小。
E、甲-的截止吸收波长在210nm附近，而乙腈的截止吸收波长在190nm附近，在测波长远离210nm的时候选择甲-或是乙腈-水系主要看其它影响因素。但是测定波长在210nm附近时，由于甲-的截止吸收波长大于乙腈，除了流动相不同外，相同的测定条件下，乙腈-水系测定的样品响应值高，从而能够得到小样品出限，此时建议选乙腈-水系。
图1 以甲--水为系的系统适用图谱
上述两个图中图2比图1多加入种杂质，即图2中的峰5，其余杂质的种类不变、出峰位置不变，上述两图主要看图谱的基线与各杂质的出峰位置。
3、确定色谱柱、流速、柱温
实验室分析中常用的是类型的色谱柱，般为5μm0.46×250mm或者是0.46×150mm，在试验前期如果在没有参考资料的情况下，为普通的 5μm0.46×250mm的色谱柱试下；如果发现用5μm0.46×250mm的色谱柱去分离多种杂质时，有分叉峰出现或是论塔板数比较低时则提示我们这种类型的色谱柱对该物质的分离是不太好的，需要我们换柱高的色谱柱，通常选择粒径、填料小的色谱柱，这个需要根据实际情况，进行试验后确定适用于测的色谱柱。
而流速的选择通常是要根据色谱柱的具类型，高的耐受压力来决定，常用的色谱柱般流速为1.0mL/min，其实流量对杂质分离的影响比较小。
柱温室温，柱温的升高会影响杂质的出峰快慢，论上柱温越高，各种物质的出峰会越快，同时色谱柱的柱压也会越小，但是由于温度比较高会导致色谱柱中填料的合相容易被流动相冲刷下来，导致色谱柱不可逆的柱下。因此色谱柱温度不过高，般温度设定为25~35℃，当然也有特殊的品种有的需要柱温在40℃甚至高。
4、梯度洗脱程序的筛选
在选择好用正反相洗脱方式、确定用的色谱柱、柱温、流速后，无论如何调整梯度及流动相比例都无将两种杂质分离开后，那么需要用到梯度洗脱方式。梯度洗脱是种在不同的时间加入不同有机比例流动相的种洗脱方式。与传统的等度相洗脱方式比具有以下点：
A、能够增加两种物质的分离度，通过不同时间段加入有机相浓度的不同，使杂质在不同时间段受到有机相洗脱的浓度不同，般原则是逐步增加有机相的比例，从而使难被洗脱出来的杂质加快出峰。
B、由于可以调整有机相加入的浓度，与等度洗脱相比，可以缩短分析时间，还可以次将等度洗脱分不开的几种物质分开，从而用种分析方分析多种物质，低成本。
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